Charles Joseph Eugène de Mazenod, fils de Charles Antoine de Mazenod et de Marie Rose Eugénie Joannis naquit à Aix-en-Provence le 1^er août 1782 où son père et son grand-père étaient présidents à la cour des comptes du Parlement de Provence.

Sa mère richement dotée, était issue d'une famille de médecins. Compte tenu du rang de son père dans l'Ancien Régime, la famille dut fuir dès les premiers troubles révolutionnaires, tout d'abord à Nice qui faisait alors partie du Royaume de Sardaigne, puis, au fur et à mesure de l'avancée des troupes révolutionnaires en Italie, à Turin (1789), où il est scolarisé au collège royal, puis à Venise (1794), Naples (1797) et enfin Palerme en Sicile.

À Venise, les conditions de vie de la famille Mazenod se font plus difficiles et les frères d'Eugène sont contraints de trouver du travail. Eugène rencontre alors un prêtre jésuite, Don Bartolo Zinelli, qui s'occupe de lui faire continuer gratuitement ses études, et qui sera à l'origine de sa vocation religieuse. 

C'est dans la pauvreté qu'Eugène de Mazenod vivra son adolescence, privé de compagnons de son âge, mais également de sa mère, rentrée en France dès la promulgation des lois sur le divorce, afin de recouvrer ses biens confisqués par la Révolution.

En 1802, un an après la signature du concordat entre Napoléon et le pape Pie VII, Eugène de Mazenod revient en France. Après des hésitations sur sa vocation avec deux projets de mariages, il décide de faire ses études théologiques au collège de Saint-Sulpice de Paris où il rentre le 12 octobre 1808.

Pendant les années de captivité du pape Pie VII par Napoléon, Eugène de Mazenod entre en résistance et sert d'agent de liaison entre le supérieur de la Compagnie des prêtres de Saint-Sulpice, le père Emery, et les cardinaux romains fidèles au pape. Fort de ses convictions, il refuse d'être ordonné par le cardinal Maury imposé par Napoléon sans l'accord du pape Pie VII.

Il est ordonné prêtre le 21 décembre 1811 par l'évêque d'Amiens, M^gr Claude Jean François Demandolx, ami de la famille et autrefois vicaire de Marseille avec son grand-oncle. Il refuse l'offre de M^gr Demandolx qui lui propose d'être son vicaire général car il veut se consacrer uniquement aux pauvres.

Lorsqu'il rentre en Provence en octobre 1812, il se consacre à l'évangélisation des pauvres avec lesquels il s'entretient en langue provençale. Il a conscience des dangers de son entreprise dans le contexte politique soupçonneux du premier empire.

En 1814, le typhus se déclare parmi les prisonniers de guerre entassés dans les prisons d'Aix-en-Provence ; en visitant les malades, il finit par être gravement atteint lui-même mais se rétablit grâce à sa robuste constitution.

Un peu plus tard, le 25 janvier 1816, il fonde les Missionnaires de Provence, avec l'assentiment des vicaires généraux d'Aix. Il installe cette nouvelle fondation dans l'ancien couvent des carmélites d'Aix.

Le souci majeur d'Eugène de Mazenod est de s'adapter à la situation réelle des gens dont la vie chrétienne a été si bouleversée depuis vingt-cinq ans. D'où un certain nombre d'innovations, en particulier les visites à domicile et l'utilisation du provençal. 

Les Missionnaires de Provence participent également à plus de quarante missions paroissiales pour prêcher sur les bases de la foi chrétienne et confesser les pénitents, favorisant un retour à la pratique religieuse dans la région, après les troubles de l'époque.

L'évêché de Marseille, supprimé en 1790, est rétabli par une ordonnance royale du 13 janvier 1823 et nomme Fortuné de Mazenod, oncle d'Eugène, évêque de Marseille. Le nouvel évêque, qui était alors âgé de 73 ans, prend pour vicaire Eugène de Mazenod ainsi que le père Tempier.

La société des Missionnaires de Provence traverse une grave crise et certains de ses membres sont rappelés dans leur diocèse d'origine. Seule une approbation par le Saint-Siège peut sauver l'institution. Eugène de Mazenod se rend à Rome où il rencontre le pape Léon XII qui approuve les statuts de cette société qui prend le nom de congrégation religieuse des « Oblats de Marie-Immaculée » (OMI) pour l'apostolat missionnaire des zones défavorisées.

En 1837, M^gr Fortuné de Mazenod âgé de 88 ans donne sa démission et, fait assez rare, son neveu lui succède. Le gouvernement de Louis-Philippe I^er qui n'a aucune sympathie pour le bouillant ecclésiastique et a failli le priver de ses droits civiques, estime qu'Eugène de Mazenod sera moins dangereux dans ces hautes fonctions. De 1837 à sa mort en 1861, l'évêque mènera de front sa tâche de pasteur et celle de supérieur des Oblats.

Le 20 juin 1841, Eugène de Mazenod reçoit M^gr Ignace Bourget, jeune évêque de Montréal, à la recherche de missionnaires. L'évêque de Marseille accepte de l'aider et six premiers missionnaires s'embarquent pour le Canada. C'est le point de départ d'une vaste évangélisation qui se poursuivra aux États-Unis, en Afrique et à Ceylan (Sri Lanka).

Au mois de novembre 1857, il reçoit la visite de M^gr de Marguerye, évêque d'Autun, venu lui demander quelques missionnaires, et en mars de l'année suivante des Oblats lui furent envoyés et installés à Autun.

En juillet 1859, M^gr de Mazenod se rend à Autun, où il est fait chanoine honoraire du Chapitre. À cette occasion, les reliques de saint Lazare d'Aix sont exposées. M^gr de Marguerye se rend à son tour en novembre de la même année avec la relique d'un bras de ce saint, et fait une retraite à Notre-Dame de la Garde^.

La maladie le surprend début janvier 1861. Doyen des évêques de France, il meurt le 21 mai 1861. Les funérailles ont lieu à l'église Saint-Martin à cause des travaux de la nouvelle cathédrale. M^gr Chalandon, archevêque d'Aix, célèbre la messe et prononce l'homélie. Son tombeau se trouve dans la chapelle axiale de la cathédrale de la Major à Marseille.

Le Père Joseph Fabre lui succède à la tête de sa congrégation. 

M^gr de Mazenod a été béatifié par Paul VI le 19 octobre 1975 et depuis lors canonisé le 3 décembre 1995 par Jean-Paul II. Il est fêté le 21 mai.